Anal. Chem. | 特异性抗坏血酸氧化纳米酶用于构建芳香胺传感阵列
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*本文首发于“纳米酶 Nanozymes”公众号，2024年8月18日。
*编辑：磨东泽
01
研究背景
多环芳烃是一类存在于环境体系里的持久性有机污染物，具有“三致”（致畸、致癌、致突变）效应，而芳香胺（2,3-萘二胺（NDA）、4-硝基-邻苯二胺（4-NO2-OPD）、4-氟-邻苯二胺（4-F-OPD）、4-氯-邻苯二胺（4-Cl-OPD）和4-溴-邻苯二胺（4-Br-OPD））是几种典型的多环芳烃污染物。目前，已经开发的芳香胺检测方法仅针对于单一芳香胺的检测，难以实现高通量识别和大规模检测，极大地限制了在环境监测中的应用。因此，迫切需要开发快速、经济、高效的检测策略。OPD及其衍生物均含有氨基取代基，可以与醛或酮中的羰基反应形成席夫碱并发出荧光，利用席夫碱化学反应监测OPD及衍生物，有可能是一种有效的策略。据文献报道，抗坏血酸（AA）氧化酶可以催化氧化AA生成脱氢抗坏血酸（DHAA），提供羰基与OPD及其衍生物结合并形成席夫碱。因此构建特异性AA氧化纳米酶期望可以实现OPD及其衍生物的监测。但目前利用AA的氧化产物DHAA识别OPD及其衍生物的传感策略尚未见文献报道。
近日，北京师范大学化学学院李晓宏教授团队在《Analytical Chemistry》上发表了题为“Visual Sensor Array for Multiple Aromatic Amines via Specific Ascorbic Acid Oxidase Mimic Triggered Schiff-Base Chemistry”的论文，报道了以Cu2+为节点，以氨基酸小分子为配体，合成一系列特异性的AA氧化纳米酶，其中以色氨酸（Trp）或精氨酸（Arg）为配体合成的AA氧化纳米酶（Cu-Trp和Cu-Arg）活性最强，可催化抗坏血酸（AA）氧化为脱氢抗坏血酸（DHAA）。生成的DHAA可与OPD及其衍生物（NDA、4-NO2-OPD、4-F-OPD、4-Cl-OPD和4-Br-OPD）反应形成席夫碱并发出荧光。基于此，以Cu-Trp+ AA和Cu-Arg+ AA为传感通道，提取发射荧光中的红、绿、蓝（RGB）值作为读出信号，构建了能有效识别低至10 μM OPD、NDA、4-NO2-OPD、4F-OPD、4-Cl-OPD和4-Br-OPD的视觉传感器阵列。通过对不同浓度比的二元、三元、五元和六元混合物和未知样品的识别，以及对单个芳香胺的定量分析，进一步证实了传感阵列的检测性能。最后，在环境水体中进一步验证了传感器阵列的识别能力，为多种芳香胺的大规模检测提供了有效的分析方法。（图1）
图1. 特异性抗坏血酸Cu-Trp和Cu-Arg氧化纳米酶的构建及其在识别芳香胺中的应用
02
文章内容
将Cu2+和Trp在10 mL 70 ℃的超纯水中混合加热并冷冻干燥，得到了Cu-Trp纳米酶。扫描电镜显示合成的Cu-Trp纳米酶呈尺寸分布均匀的球形，粒径大小约为100 nm，X射线能谱元素像分析图谱显示Cu-Trp纳米酶由Cu，C，N，和O元素组成，四种元素均匀分布在纳米材料上。除此之外，利用X射线光电子能谱证实Cu通过Cu-O和Cu-N键与Trp配位结合，并通过红外光谱证实Trp中‐NH2的N，吲哚基团中的N，-COOH中-OH的O和C=O中的O均与Cu2+结合。根据以上结果，提出了Cu-Trp纳米酶配位结合模式图（图2A）。
图2.（A）Cu2+与Trp结合形成Cu-Trp纳米酶的示意图。（B）Cu-Trp的SEM图像（插图为放大视图）。（C）Cu-Trp的的EDX元素映射图谱图。（D）Trp和Cu-Trp的XPS全谱图。（E）Trp和Cu-Trp的O 1s的高分辨谱图。（F）Trp和Cu-Trp的N 1s的高分辨谱图。（G）Trp和Cu-Trp的FTIR光谱。
以抗坏血酸（AA）为底物，研究了Cu-Trp的催化性能。实验表明Cu-Trp可以催化氧化AA为DHAA，但不能催化氧化常用模拟底物TMB, ABTS, 2,4-DP, OPD以及OPD衍生物，显示出对AA的特异性催化氧化性能。进一步选择其他天然氨基酸作为配体，合成相应的铜基纳米酶，同样观察到AA的催化氧化，并且催化性能依赖于氨基酸的种类，其中Cu-Trp和Cu-Arg的催化活性最好。稳态动力学分析表明，与天然AAO相比，Cu-Trp和Cu-Arg的Km更小，Vmax相似。
图3. （A）在O2-，空气-和N2 -饱和PBS溶液（20 mM, pH = 7）中，存在Cu-Trp和不存在Cu-Trp时AA的紫外-可见吸收光谱。（B）存在Cu-Trp和不存在Cu-Trp时AA的ESI-MS质谱图。Cu-Trp存在和不存在时TMB （C）、ABTS （D）、2,4-DP+ 4-AP（E）和OPD （F）的紫外-可见吸收光谱。（G）以氨基酸为配体的铜基纳米酶的催化活性比较。（H）不同AA浓度下Cu-Trp的Michaelis-Menten曲线和Lineweaver-Burk图（插图）。（I）不同AA浓度下Cu-Arg的Michaelis-Menten曲线和Lineweaver-Burk图（插图）。
验证了DHAA和OPD及其衍生物之间的席夫碱反应：紫外-可见吸收光谱观察到了对应席夫碱的特征峰，荧光发射光谱探究了OPD及其衍生物生成对应席夫碱发射的荧光颜色和强度。
图4. （A） OPD存在下Cu-Trp+ AA和Cu-Arg+ AA的紫外-可见吸收光谱。Cu-Trp/ Cu-Arg+ AA在OPD （B）、NDA （C）、4-NO2-OPD（D）、4-F-OPD （E）、4-Cl-OPD （F）、4-Br-OPD （G）存在下的荧光发射光谱。（H）在365 nm处激发的相应荧光照片。
基于上述实验结果，以Cu-Trp+ AA和Cu-Arg+ AA为传感通道，提取发射荧光中的红、绿、蓝（RGB）值作为读出信号，构建了能有效识别低至10 μM的OPD、NDA、4-NO2-OPD、4-F-OPD、4-Cl-OPD和4-Br-OPD的视觉传感器阵列。通过对不同浓度比的二元、三元、五元和六元混合物的鉴别，对18个未知样品的识别，甚至对单个芳香胺的定量分析，进一步证实了以上传感器的检测性能。最终成功应用于环境水体系里的识别、监测和混合物的区分，具有潜在的应用价值。
图5：比色传感器阵列示意图。
图6. 海水（A）、自来水（B）、污水（C）和河水（D）的LDA图。（E）混合LDA图。（F）混合LDA图。（G）10 μM ~ 10 mM OPD的LDA图。（H）Factor 1与COPD的线性关系图。
03
结果与讨论
综上所述，本工作以Cu2+为金属中心，单一氨基酸为配体，合成了一系列铜基纳米酶，展示出特异性催化氧化抗坏血酸（AA）的性能。选取活性最强的Cu-Trp（铜-色氨酸）和Cu-Arg（铜-精氨酸）氧化纳米酶，利用AA的氧化产物DHAA分别与OPD、NDA、4-NO2-OPD、4-F-OPD、4-Cl-OPD和4-Br-OPD发生席夫碱反应并发射不同荧光。以Cu-Trp + AA和Cu-Arg + AA传感通道，提取发射荧光的红绿蓝（RGB）为输出信号，构建了视觉传感器阵列，可以准确识别低至10 μM的六种芳香胺。该传感器阵列以100%的准确度区分了不同浓度比的多元混合物和18个未知样品，实现了在环境水体系里高通量识别和量化芳香胺，为大规模检验环境水样中的芳香胺提供了一种更便携高效和具有普适性的方法，证明了其潜在的应用价值。
